Abstract
In recent years great interest has been generated in the process of protein folding, and the formation of intermediates during the folding process has been proven with new experimental strategies. In the present work, we have examined the molten globule state of Bacillus licheniformis alpha-amylase (BLA) by intrinsic fluorescence and circular dichroism spectra, 1-anilino naphthalene-8-sulfonate (ANS) binding and proteolytic digestion by pepsin, for comparison to its mesophilic counterpart, Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase (BAA). At pH 4.0, both enzymes acquire partially folded state which show characteristics of molten globule state. They unfold in such a way that their hydrophobic surfaces are exposed to a greater extent compared to the native forms. Chemical denaturation studies by guanidine hydrochloride and proteolytic digestion with pepsin show that molten globule state of BLA is more stable than from BAA. Results from gel filtration indicate that BAA has the same compactness at pH 4.0 and 7.5. However, molten globule state of BLA is less compact than its native state. The effects of polyols such as trehalose, sorbitol and glycerol on refolding of enzymes from molten globule to native state were also studied. These polyols are effective on refolding of mesophilic alpha-amylase but only slightly effect on BLA refolding. In addition, the folding pathway and stability of intermediate state of the thermophilic and the mesophilic alpha-amylases are discussed
چکیده
در سال های اخیر علاقه زیادی به بررسی روند چین خوردگی پروتئین ایجاد شده و شکل گیری واسطه در فرایند تاشو شدن با استراتژی های تجربی جدید ثابت شده است. در این کار، ما حالت گلبول مذاب باسیلوس لیشنی α- آمیلاز (BLA) را توسط فلورسانس ذاتی و طیف دورنگ نمایی مدور، اتصال 1-آنیلینو نفتالین-8-سولفونات (ANS) و هضم پروتئولیتیک های پپسین را ، برای مقایسه با همتای مزوفیل، باسیلوس آن مورد بررسی قرار دادیم. در pH 4.0، هر دو آنزیم تا حدی حالت تا شده دارند که نشان دهنده ویژگی های حالت گلبول مذاب است. آنها به گونه ای که سطوح آب گریز آنها به میزان بیشتری نسبت به فرم های اصلی آشکار شوند، باز میشوند. مطالعات دناتوراسیون (واسرشت سازی) شیمیایی بر گوانیدین هیدروکلراید و هضم پروتئولیتیک با پپسین نشان می دهد که حالت گلبول مذاب BLA با ثبات تر از BAA است. نتایج فیلتراسیون با ژل نشان می دهد که BAA در pH 4.0 و 7.5 مشابه است. با این حال، فشردگی حالت گلبول مذاب BLA از حالت طبیعی کمتر است. اثرات پلییولها مانند ترهالوز، سوربیتول و گلیسرول در تا شدن مجدد آنزیم های گلبول مذاب به حالت طبیعی نیز مورد بررسی قرار گرفت. این پلییولها در تاشدن مجدد آمیلاز α- مزوفیل موثرند اما تنها مقدار اندکی در تاشدن مجدد BLA تاثیرگذار است. علاوه بر این، مسیر تاشدن و ثبات حالت حدواسط گرمادوست مزوفیل α-آمیلاز مورد بحث قرار گرفته است.
1-مقدمه
استراتژی که طبیعت برای ایجاد ثبات در ساختارهای سلولی، به ویژه پروتئین ها، و تحت شرایط سخت استفاده میکند هنوز هم با وجود 25 سال تحقیق فعال مبهم است[1-4]. آنچه مشخص شده است این است که پروتئین ها، مستقل از منشاء مزوفیل یا extremophilic خود، منحصرا شامل 20 اسید آمینه طبیعی متعارف هستند، و اگر ترکیبات پروتئین دیگری یافت می شوند، از تغییرات شیمیایی پیوندهای کووالانسی سرچشمه گرفته است[1]. بر اساس توالی ژنوم کامل آب گریزی و مقایسه نظام مند موجودی پروتئین با همتایان مزوفیل مناسب آنها ، داده های جمع شده نشان می دهد که ثبات شامل تمام سطوح ساختار سلسله مراتبی پروتئین ، به عنوان مثال، ساختار ثانویه ، فوق ثانویه، سوم، و تداخلات چهارگانه است [5-9]. علاوه بر این، اخیرا نشان داده شده است که چین خوردگی پروتئین های بزرگتر اغلب شامل حالات چین خورده جزئی پروتئین است...