Abstract
An extracellular lipase (EC 3.1.1.3), SAL-PP1, from Staphylococcus aureus isolated fromArachis hypogaea rhizosphere was purified and characterized. The enzyme was purified using PALL'S Microsep centrifugal device (10 kD cut off), hydrophobic interaction (phenyl sepharose CL-4B column) and Superose-12 gel filtration chromatography and found to have a molecular mass of around 49 kDa. The gene fragment encoding the part of the catalytic site of the SAL-PP1 lipase was sequenced and the deduced amino acid sequence shows 93% identity with that of SEL3. SAL-PP1 showed activity against long acyl-chain triglycerides, various p-nitrophenyl esters and phospholipids. The enzyme shows high stability and activity after incubation with various metal ions (retained >90% activity in presence of Ca2+, Na+, Cu2+, Mg2+, Fe2+, or Hg2+ at 10 mM), organic solvents (retained >80% activity in presence of acetonitrile, ethanol, DMSO, methanol, isopropanol, toluene, or ethylene glycol at 10 mM), detergents (retained >70% activity in Triton X-100, Tween 80, or sodium deoxycholate at 10 mM) and irreversible inhibitors (retained >77% activity in presence of PMSF, leupetin, or β-mercaptoethanol, at 1 mM). Thermal inactivation studies revealed a temperature dependent unfolding of secondary structure of protein. SAL-PP1 showed maximal activity and stability at pH 8.0 and pH 9.0, respectively. The alkali-thermostability, organic solvent-tolerance and broad substrate specificity of this enzyme may have potential implications in detergent formulations, biotransformation, industries, and medicine
چکیده
یک لیپاز خارج سلولی (EC 3.1.1.3) از Staphylococcus aureus جدا شده از ریزوسفرArachis hypogaea پالایش و تصفیه شد. آنزیم با استفاده از ابزار سانتیریفیوژ PALLS Microsep (10 kd)، تبادلات آب گریز (فنیل سفاروز cl-48 ستونی) و کروماتوگرافی تصفیه ی سفاروز – 12 ژلی خالص سازی شد و جرم مولکولی در حدودkd 49 گزارش شد. قطعه ژن کد کننده ی بخشی از منطقه ی کاتالیزور کننده ی لیپاز SAL – PPI زنجیره یندی شد و بررسی زنجیره ی اسید آمینه نشان داد که 93 درصد آن با SELS.SAL-PPI پوشانده شده است. SAL-PPI نشان داد که فعالیتها برخلاف زنجیره ی تری گلیسریدهای بلند، استرهای P – نیتروفنیل های متنوع و فسفولیپیدها پیش می رود. آنزیمها نشان دادند که پایداری بالا و فعالیت پس از انکوباسیون با یونهای فلزی متنوع (فعالیت بیشتر از 90 درصدی با وجود کلسیم، سدیم، مس، منیزیم، آهن یا جیوه در 10 میلی مول)، حلال های آلی (حفظ 80 درصدی با وجود استرونیتیل، اتانول، DMSO، متانول، ایزوپروپانول، تولوئن یا اتیلن گلیکول در 10 میلی مول)، مواد پاک کننده (حفظ بیشتر از 70 درصدی فعالیت در تریتون، X-100، تویین 80 یا دی اکسی چلات سدیم در 10 میلی مول) و بازدارنده های برگشت ناپذیر (حفظ بالاتر از 77 درصدی فعالیت در کنار PMSF، لئوپتین یا B – مروپتااتانول در 1 میلی مول) در آن دیده می شود. مطالعات مربوط به غیر فعال سازی گرمایی نشان دادند که دما وابستگی زیادی به عدم پیچیدگی ساختار ثانویه ی پروتیین دارد. SAL-PPI نشان داد که حداکثر فعالیت و پایداری در PH 8 و 9 اتفاق می افتد. پایداری گرمایی – قلیایی، بردباری حلال های آلی و بستر فعالیت این آنزیم نقش مهمی در فورمولاسیون مواد پاک کننده، بیو ترانسفروماسیون، صنایع و داروها دارد.
1-مقدمه
لبپازها هیدرولازهای تری اکیبگلیسرول هستند (EC 3.1.1.3) که هر رو هیدرولیز و سنتز اکسلگلیسرول، استرهای اسیدهای چرب دیگر، زنجیره های کوتاه و آروماتیک و اسیذهای پیچیده را کاتالیز می کنند. اگر چه لیپازها به وسیله ی جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم ها تولید می شوند (1)، اما لیپازهای میکروبیایی به واسطه ی پایداریشان کاربردهای تجاری دارند (2). مشابه استراز، لیپاز عمل می کند اما برخلاف آنها یبر روی استرهای نامحلول درآب فعالیت می کند (2) و در فضای آب – چربی فعال سازی می شود (2). به هر حال تحرک بالای مارپیچ ابتدایی در لیپاز Thermomyces lanuginose (TIL) در یک محیط آبی سوالاتی در مورد تئوری آنزیمی دو وضعیتی را به ذهن متبادر می کند، این مدل اشاره می کند که فعالیت اندک آنزیمها با توجه به بسترهای محلول در آب تنها به واسطه ی از بین رفتن بخش فعال در زمان عدم جذب پروتیین در یک ساختار آب – روغن قابل توجیه است (3). آن آشکار می کند که حتی در حضور یک فضای آب – روغن یک تعادل ظریف بین هر دو ترکیب لیپازها به وجود می آید (3). لبپازها کاربرد زیادی در صنعت و داروسازی دارند (4)، همچنین آنها نقش مهمی در سیستم های حلال آبی و غیر آبی دارند (2) و توانایی سنتز مجموعه ای از اسیگلیسرول و استرها از طریق استرسازی را را دارا هستند (4)...