Abstract
A "bottom-up" proteomics approach and a two-dimensional (strong cation exchange followed by reversed-phase) LC-MS/MS strategy on a linear ion trap (LTQ) were utilized to identify and compare expressions of extracellular and membrane-bound proteins in the conditioned media of three breast cell lines (MCF-10A, BT474, and MDA-MB-468). Proteomics analysis of the media identified in excess of 600, 500, and 700 proteins in MCF-10A, BT474, and MDA-MB-468, respectively. We successfully identified the internal control proteins, kallikreins 5, 6, and 10 (ranging in concentration from 2 to 50 microg/liter) in MDA-MB-468 conditioned medium as validated by ELISA and confidently identified Her-2/neu in BT474 cells. Subcellular localization was determined based on Genome Ontology terms for all the 1,139 proteins of which 34% were classified as extracellular and membrane-bound. Proteomics analysis of MDA-MB-468 cell lysate demonstrated that only 5% of all identified proteins were extracellular. This confirmed our hypothesis that examining the CM of cell lines, as opposed to the cell lysates, leads to a significant enrichment in secreted proteins. Tissue specificity, functional classifications, and spectral counting were performed. Elafin, a protease inhibitor, identified in the conditioned media of BT474 and MDA-MB-468 and the three kallikreins (KLK5, KLK6, and KLK10) were validated using an immunoassay on various serum and biological samples. Some of the secreted proteins identified have established roles in breast cancer development (cell growth, differentiation, and metastasis) and/or are linked to early onset breast cancer. Our approach to mining for low abundance molecules could identify proteins in various stages of breast cancer development. Many of the identified proteins are potentially useful to investigate as circulating serum breast cancer biomarkers
چکیده
روش پروتئومیکس " bottom-up (پایین به بالا)" و استراتژی LC-MS / MS دو بعدی (تبادل کاتیونی قوی همراه با فاز معکوس) در یک تله خطی یون (LTQ)، برای شناسایی و مقایسه بیان پروتئین های خارج سلولی و متصل به غشای سه لاین سلولی سینه (MCF-10A ، BT474 و MDA-MB-468) در محیط کشت های شرطی مورد استفاده قرار گرفت. آنالیز پروتئومیکس محیط کشت بیش از 600، 500، و 700 پروتئین به ترتیب در MCF-10A، BT474 و MDA-MB-468 را مشخص کرد. ما با موفقیت پروتئین های کنترل داخلی، kallikreins 5,6,10 (در محدوده غلظت 2-50 میکرو گرم / لیتر) را در محیط کشت MDA-MB-468 بوسیله ELISA (الایزا) شناسایی کردیم و با اطمینان HER-2/neu را در لاین سلولی BT474 شناسایی کردیم. جا یابی درون سلولی بر اساس شرایط انتولوژی ژنوم برای همه 1139 پروتئین انجام شد که 34٪ به عنوان خارج سلولی و متصل به غشاء طبقه بندی شدند. آنالیز پروتئومیکس از عصاره سلولی MDA-MB-468 نشان داد که تنها 5درصد از همه پروتئین های شناسایی شده، خارج سلولی می باشند. این فرضیه ما را تایید کرد که بررسی CM رده های سلولی، بر خلاف تجزیه سلولی، منجر به غنی سازی قابل توجهی در پروتئین های ترشحی می شود. تشخیص بافت، طبقه بندی های عملکردی، و شمارش طیفی انجام شد. Elafin، یک مهار کننده پروتئاز، در محیط کشت BT474 و MDA-MB-468 و سه kallikrein (KLK5، KLK6 و KLK10) شناسایی شدند و با استفاده از روش ارزیابی ایمنی در سرم های مختلف و نمونه های زیستی تایید شدند. برخی از پروتئین های ترشحی شناسایی شده، در ایجاد سرطان سینه نقش دارند (رشد سلول، تمایز و متاستاز) و یا با شروع سرطان سینه مرتبط هستند. رویکرد ما در بررسی فراوانی مولکول ها می تواند پروتئین های مراحل مختلف ایجاد سرطان سینه را شناسایی کند. بسیاری از پروتئینهای شناسایی شده به طور بالقوه، میتوانند به عنوان مارکرهای زیستی سرطان سینه مفید باشند.
1-مقدمه
سرطان سینه علت مرگ و میر در میان زنان مبتلا به تومورهای جامد در شمال امریکا است(1). این بیماری مربوط به اواسط و اواخر زندگی است و75٪ از سرطان سینه در زنان بالای 50 سال تشخیص داده می شود (2). اگر چه سرطان سینه در سنین جوانی کمتر معمول است، زنان جوان فرم تهاجمی تر بیماری را نسبت به زنان مسن تر نشان می دهند. زمانی که سرطان به سینه محدود می شود، میزان بقای 5 ساله نزدیک به 97٪ است (2). با این حال، اگر در زمان تشخیص سرطان سینه متاستازکرده باشد، بقای 5 ساله حدود 23٪ است. الگوهای بیان ژن برای طبقه بندی تومورهای سینه به زیر گروه های بالینی مربوطه (مجرای A، مجرای B ، بازال، بیان بالای ژن ERBB2 و شبه طبیعی) استفاده شده است (3 و 4). به طور کلی، انواع زیر گروه های مجرایی گیرنده استروژن (ER)- مثبت می باشند و به آرامی رشد می کنند ، در حالی که انواع پایه فاقد ER بوده و معمولا سرطان های درجه بالا هستند که به سرعت رشد می کنند. به تازگی طبقه بندی مولکولی براساس بررسی بیان پروتئین تایید شده است..